【摘要】 目的 研究松针油抗甲型流感病毒的作用。方法 采用细胞病变抑制实验、噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性，以治疗指数(TI)为评价指标，观察松针油在MDCK细胞中对甲型流感病毒的抑制作用。结果 松针油的细胞毒性较低,松针油在一定浓度范围内对流感病毒有直接灭活作用；在吸附阶段和合成阶段都能抑制流感病毒的复制，但松针油不能阻止病毒侵入细胞。结论 松针油具有很好的抗甲型流感病毒的作用。
【关键词】 松针油 甲型流感病毒 MTT法 CPE
流感病毒表面抗原容易变异的特性导致使用疫苗预防流感效果欠佳,目前应用的抗流感药物具有明显的副作用，因此有必要开发更安全、有效的新型抗流感病毒的药物。现代研究表明,松针具有镇痛、抗炎、镇咳、祛痰、抗突变、降血脂、降血压、抑菌等作用〔1〕,其利用价值日益受到重视。松针油抗流感病毒研究目前未见报道，本研究旨在探讨松针油抑制甲型流感病毒的作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 材料 甲型流感病毒A3 (A/京防/256/97)由中国预防医学科学院病毒学研究所提供；狗肾传代细胞(MDCK)由武汉大学典型培养物保藏中心提供, 常规方法传代培养。松针叶采于广州市；病毒唑注射液为山东益康药业有限公司市售商品,50 mg/ml,批号：200211061；新生牛血清（杭州四季青生物公司）；RPMI 1640培养液（美国Gibco公司）；MTT（美国Sigma公司）；二甲基亚砜(DMSO,上海菲达有限公司)；胎牛血清(美国Hyclone 公司)；MTT(四甲基偶氮唑盐，美国Sigma公司)。
1.2 方法
1.2.1 松针油提取 采用水蒸气蒸馏法。松树叶在实验室阴干后切成小于2 cm的小段,取针叶100 g加到1 000 ml的圆底烧瓶中，加入750 ml蒸馏水，置于水蒸气蒸馏装置中进行提取，蒸馏4 h，取上层精油，用无水乙醚溶解，无水硫酸钠脱水，得到淡黄色油状液体，冷藏备用。
1.2.2 松针油成分分析 用气相色谱质谱联用仪进行分析。精油气相色谱条件：色谱柱为HP5石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱温35℃，以每分钟5℃升温至100℃，停留8 min，每分钟5℃升温至190℃，停留5 min，以每分钟10℃升温至280℃，保持至完成成分分析。进料量为0.5 μl，载气He，载气流量1.0 ml/min，分流比50∶1，质谱条件为离子源温度220℃，注入口温度为240℃，电子能量70 eV。
1.2.3 药物配制 用RPMI1640培养液将松针油(1.05 g/ml)按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200和1∶102 400比例进行稀释, 其药液质量浓度分别为10.5、5.25、2.625、1.31、0.656、0.328、0.164、0.08、0.04 、0.02和0.01 mg/ml。
1.2.4 流感病毒的传代及效价测定 将病毒液接种于9日龄鸡胚尿囊腔,0.2 ml/个,37℃培养48 h ,4 ℃过夜后收取尿囊液。红细胞凝集(血凝) 试验测定病毒血凝效价为1∶1 024。红细胞凝集试验按文献〔2〕方法进行。
1.2.5 病毒毒性测定 以50%组织培养感染量(TCID50)表示病毒毒力。将病毒培养液做10倍系列稀释从10-1至10-10。将各稀释度的病毒液接种于单层MDCK细胞中，每一稀释度8个复孔，同时设阴性对照，37℃培养3～5 d，观察细胞病变(CPE)，用ReedMuench法求出细胞半数感染量（TCID50）。
1.2.6 松针油毒性测定 将细胞维持液稀释的不同浓度松针油分别加入MDCK细胞已长成单层的96孔细胞培养板中,每个浓度重复8个复孔，同时设立正常细胞对照,置于37℃、5%CO2 培养箱内培养,连续观察3 d,记录细胞形态变化。培养结束前4 h吸弃培养板中液体，PBS冲洗3次，每孔加入MTT（5 mg/ml）20 μl，于37℃
